Es werden Methoden zur Einführung nichtnatürlicher Aminosäuren an definierte Stellen in Proteinen besprochen. Dabei geht es in erster Linie darum, entsprechende nicht verwendete Codons einer mRNA für die nicht proteinogene „neue“ Aminosäure zu finden. Eine korrespondierende tRNA muss dann entweder durch Synthese oder mithilfe einer speziellen Aminoacyl-tRNA-Synthetase mit der neuen Aminosäure konjugiert werden. Es wurden zunächst In-vitro-Expressionssysteme entwickelt, die aber in der Folge durch In-vivo-Expression ersetzt wurden. Beispiele nichtnatürlicher Aminosäuren sind solche, die Fluorophore, funktionelle Gruppen für Photoaffinitätsmarkierungen oder in vivo abspaltbare Schutzgruppen tragen. Aber es können so auch Aminosäuren mit posttranslationalen Modifikationen direkt eingeführt und getestet werden. In jüngster Zeit erleben auch spezielle zellfreie Expressionssysteme eine Renaissance.