DNA-Sequenzassemblierung und Annotation von Genen

Dieses Kapitel beschreibt die verschiedenen Sequenzierungsstrategien, die Vor- und Nachteile der verschiedenen Strategien, um Ihnen bei der Auswahl der optimalen Methode für Ihre Forschungsfrage zu helfen, sowie die Assemblierung und die Annotation von DNA-Sequenzen. Bei der DNA-Sequenzierung wird die Reihenfolge der Nukleotide von Teilen oder ganzen Chromosomen von Organismen und Viren bestimmt. Die DNA-Sequenzierung kann für ein einzelnes Gen, ein ganzes Genom oder viele Genome gleichzeitig durchgeführt werden, wie zum Beispiel in der Metagenomik. Eine der beliebtesten Sequenzierungsplattformen ist MiSeq von Illumina, die in der Lage ist, kleine Gesamtgenomsequenzierungen, Transkriptomik und 16S-rRNA-Metagenomik auszuführen. Durch Verwendung einzigartiger Kombinationen an spezifischen Barcodes und Indizes ist Multiplexing möglich. Einzelmolekülsequenzierung in Echtzeit erlaubt die Sequenzierung nativer DNA, was zu deutlich längeren Read-Längen und genaueren Sequenzinformationen führt, die verfügbar sind, noch während die Nukleotide eingebaut werden. Base Calling ist der erste Schritt bei der Sequenzierung, bei dem das elektronische Signal, das in der Sequenzierungsmaschine erzeugt wird, von zufälligem Rauschen getrennt und in Nukleotidinformationen umgewandelt wird. Anschließend müssen die Nukleotidinformationen zu DNA-Sequenzen zusammengesetzt werden, die der ursprünglich sequenzierten DNA so gut wie möglich entsprechen. Dies kann entweder de novo ohne Referenz oder mithilfe einer Referenz erfolgen, wenn das Genom des Organismus oder Virus gut bekannt ist. Der wichtigste zu berücksichtigende Qualitätsparameter ist die sogenannte Coverage. Ein weiterer wichtiger Parameter ist N50. Vergleiche verschiedener Assemblierungen können mit Quast gemacht werden. Die Mindestinformationen über eine Genomsequenz (MIGS) bieten eine erschöpfende Liste der für genomische Sequenzen erforderlichen Informationen, einschließlich der Anforderungen an Metadaten. Die Genomannotation beinhaltet die Identifizierung und Kennzeichnung aller relevanten Merkmale der genomischen Sequenz. Dies schließt die Nukleotidpositionen ein, an denen kodierende Regionen vorhergesagt werden. Es handelt sich hauptsächlich um eine Vorhersage von kodierenden Genen; jedoch werden auch andere strukturelle Gene wie rRNA identifiziert.